Бержанова Р.Ж., Шигаева М.Х., Мукашева Т.Д., Абилова С.Е,

Сыдыкбекова Р.К..

Казахский национальный университет им. аль-Фараби

Углеводородокисляющие дрожжи РОДА TRICHOSPORON

С тех пор как было обнаружено биологическое окисление углеводородов, исследователи уделяют большое внимание изучению микроорганизмов, обладающих способностью усваивать эти соединения. Нефтеокисляющие микроорганизмы относятся в основном к бактериям, однако, значительный интерес представляют одноклеточные грибы и мицелиальные организмы, также способные использовать углеводороды. Углеводородокисляющие дрожжи широко распространенны водных экосистемах, встречаются в нефтезагрязненных почвах. Известны такие виды дрожжей как Rhodotorula rubra, Cryptococcus laureпtii var flavesceпs, Metschпikowia pulcherriтa, Caпdida. pulcherriтa Caпdida. laureпtii var flavesceпs, Torulopsis candida, T. pulcherriтa способные окислять углеводороды нефти. Способность утилизировать углеводороды, наиболее широко представлена среди аспорогенных дрожжей семейства Cryptococaceae, особенно среди дрожжей рода Caпdida. В экстремальных условиях (в кислой среде, ограничении в питательных веществах) как деструкторы углеводородов более эффективны дрожжи и грибы, кроме того, они активны на поздних стадиях разложения углеводородов. Этим объясняется интерес к этой группе микроорганизмов-деструкторов.

Настоящее исследование посвящено дрожжам рода Trichosporon, выделенные методом продленного культивирования из нефтезагрязненных почв Атырауской области.

В работе были использованы 15 новых штаммов дрожжей рода Trichosporon. В результате изучения морфологических и физиолого-биохимических признаков штаммы были отнесены к различным видам. Штамм МСМ7 был близок к виду Trichosporon figuirae, штамм СМ7 определен как Trichosporon terrestre, штамм 7СКР идентифицирован как Trichosporon finnicum, а штамм 7СА отнесен к виду Trichosporon capitatum, остальные штаммы не были идентифицированы.

По результатам визуальных исследований было установлено, что при росте дрожжевых штаммов 7СКР, 7СА, СМ7, МСМ7 и МСМ57 на синтетической среде с нефтью среде (70 мл/л тенгзской нефти) наблюдали изменение цвета нефти от темно-коричневого до светло-коричневого, стенки колб оставались чистыми, нефтяная пленка разрушалась, и нефть превращалась в мелкодисперсную суспензию. Штаммы CМ7, 7СА и 7СКР проявили диспергирующую способность только в минеральной среде, нарушалась однородность нефтяной пленки, которая разделялась на сегменты и мелкие глобулы светло-коричневого цвета, а на искусственной морской воде, они не проявили диспергирующей способности. Нефтедиспергирующая активность в отношении тяжелой кумкольской нефти проявилась на 3 сутки, наблюдалось разрушение нефтяной пленки, нефтяная пленка превращалась во взвесь мельчайших частиц. Факт диспергирвания нефти, говорит о том, что данные штаммы способны синтезировать и секретировать ПАВ, эмульгирующее нефть. Нефтесобирающие свойства, как и нефтедиспергирующие изучали в модельных опытах, имитирующих разлив нефти на поверхности водных сред. Нефтесобирающую активность определяли по уменьшению нефтяного пятна и обозначали как кратность собирания. Нефтесобирающие свойства отмечены у всех исследованных культур рода Trichosporon на искусственной морской воде легкой на тенгизской нефти. Кратность собирания нефти на искусственной морской воде у штаммов 7СКР, 7СА, МСМ7 и МСМ57 составила 6,9 и 7,3, 5,7 и 5,8 соответственно. В контрольной колбе нефть представляла собой маслянистую пленку темно-коричневого цвета, толщиной около 3 мм, покрывающую всю поверхность среды. При проведении количественных исследования установлено, что штамм СМ7 утилизировал – 47,5 %, МСМ7 – 43,1 %, МСМ57 – 43,7 %, 7СКР – 42,9 %, а у штамма 7СА степень потребления 70 мл/л нефти составило 38,9 %.

Степень потребления дизельного топлива и бензина была в пределах 42- 55 % при первоначальном содержании его содержании в среде 50 мл/л. Моторное масло и мазут относится к труднодеградируемому субстрату, в связи с этим их количество в суспензионной среде было меньше (30мл/л) по сравнению с другими нефтепродуктами. Так, количество использованного моторного масла составило от 63 до 71 %, а мазута в прелделах 9 % -10 %. штаммы способны активно утилизировать нефть и нефтепродукты в суспензионной культуре. Таким образом, по результатам модельных исследований установлено, что новые штаммы дрожжей рода Trichosporon обладают нефтесобирающей активностью, высокой деструктивной способностью.

Первичная оценка способности микроорганизмов образовывать поверхностно-активные вещества оценивали по индексу эмульгирования Е₂₄. Для штаммов 7СКР, СМ7 и 7СА наиболее высокие значения индекса эмульгирования отмечены на тенгизской нефти до 52,2%, по сравнению с эмульгированием моторного масла. На моторном масле значения индекса эмульгирования для всех дрожжевых культур колебалось в пределах 30,1 и 35,3% соответственно. Культура Trichosporon sp. СМ7 показала высокие значения Е₂₄ выше 50% на 3 - х углеводородных субстратах и значения Е₂₄ было выше 50% (таблица 1).

Таблица 1 – Показатель индекса эмульгирования (Е₂₄) культуральной жидкости нефтеокисляющих дрожжей на различных субстратах (%)

Культуры дрожжей	Субстраты
	вазелиновое масло	дизельное топливо	Тенгизская нефть	моторное масло
Trichosporon figuirae МСМ7	43,6±0,25	48,6±1,1	49,1±0,1	31,1±0,7
Trichosporon terrestre СМ7	51,6±0,97	56,6±0,89	52,9±0,91	35,3±1,1
Trichosporon finnicum 7СКР	48,2±0,91	45,6±1,1	52,7±0,56	35,2±0,56
Trichosporon capitatum 7СА	48,3±1,0	48,9±0,23	52,2±0,37	35,7±0,78
Trichosporon sp. МСМ57	50,3±1,0	48,0±0,23	50,2±0,37	30,7±0,51

На нефти высокие значения Е₂₄ отмечены у штаммов 7СКР, СМ7 и 7СА в пределах о 52,9 % соответственно, а у штамма СМ57 было зафиксировано в пределах 50%. Так, при использовании в качестве гидрофобного субстрата моторного масла индекс эмульгирования у всех культур было в пределах 35 %, а у одного штамма МСМ57 значения Е₂₄ было 30%. Известно, что эмульгирующая активность культуральной жидкости является важной, характеристикой штаммов-деструкторов углеводородов нефти. Эмульгирующую активность культуральной жидкости штаммов дрожжей изучали в динамике развития среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии гидрофобные субстраты.

Установлено, что у всех дрожжевых культур рода Trichosporon значительное повышение эмульгирующей активности культуральной жидкости, которые наблюдались ко 2 суткам роста. Динамика эмульгирующей активности культуральной жидкости у всех дрожжей на гидрофобных субстратах сходна, низкая в первые часы роста, затем постепенно нарастала, достигая максимальной величины к 3 суткам культивирования. После этого эмульгирующая активность постепенно снижалась.

Значения эмульгирующей активности культуральной жидкости у штаммов 7СА и СМ7 на дизельном топливе были высокие начиная с 3 суток и сохранялись до 5 суток. При изучении гидрофобности клеточной поверхности у дрожжевых культур можно отметить, что у культур МСМ7, 7СА, 7СКР и СМ7 наиболее высокие значения Г% наблюдаются на 3 сутки культивирования, значения гидрофобности клеточной поверхности составили 65 и 70 %. П У штамма СМ7 наблюдали отрицательные значения Г% на пятые сутки, то есть наблюдался «эффект гипергидрофобности».

Одно из основных требований к вводимым штаммам при биоремедиации почв и водоемов – высокая углеводородокисляющая активность [9]. В эксперименте был использован сложный для биодеградации субстрат - мазут, содержащий тяжелые фракции нефти, смолы, асфальтены и другие поллютанты. Инокуляцию осуществляли однократно из расчета по 15 г биомассы дрожжей на 3 кг почвы. Так, первоначальное содержание мазута в почве составило 130161 мг/кг почвы, что превышает уровень ПДК в 1000 раз.

При интродуцировании клеток штаммов Trichosporon finnicum 7СКР и Trichosporon capitatum 7СА остаточное количество мазута в почве было самым низким и составило 58196 и 58995 мг/кг почвы соотвественно. В варианте с Trichosporon terrestre СМ7 количество неутилизированного мазута в почве составило - 68161 мг/кг почвы, наимее активна биомасса штаммов Trichosporon figuirae МСМ7 и Trichosporon sp. МСМ57 остаточное количество мазута в почве составило 70126 мг/кг почв и 71206 мг/кг почвы соотвественно (таблица 2).

Таблица 2 – Остаточное содержание мазута в почве при интродукции дрожжей рода Trichosporon

Культуры дрожжей	Содержание мазута в почве мг/кг почвы через		Процент проросших семян редиса, %
	0 сутки	30 сутки
Trichosporon figuirae МСМ7	130160	70126±2,3	70,1
Trichosporon terrestre СМ7	130165	68161±4,5	69,3
Trichosporon finnicum 7СКР	130069	58196±3,2	85,2
Trichosporon capitatum 7СА	130061	58995±2,5	85,3
Trichosporon sp. МСМ57	130163	71206±2,8	71,1
контроль	130161	98160±3,1	10,4

Паралельно было проведено определение фитотоксичности почв с использованием в с качестве тест семена редиса. Фитотоксичность рекультивируемой почвы была различна и зависела от интродуцмуруемого штамма. Максимальная токсичность отмечена в контрольном варианте, минимальная – после внесения культур Trichosporon finnicum 7СКР и Trichosporon capitatum 7СА, которые продемонстирировали фитостимулирующий эффект, процент проросших семян редиса в этих вариантах составил 85 %, в остальных вариантах от 69 % до 71 %.

Таким образом, впервые из нефтезагрязненных почв Атырауской области выделены углеводооокисляющие дрожжи рода Trichosporon, которые способны активно утилизировать нефть и нефтепродукты в суспензионной культуре и могут быть использованы в качестве кандидатов при создании микробных препаратов для биоремедиации.