Определение филадельфийской хромосомы у больных хроническим миелолейкозом, проживающих в Карагандинской области

Коновалова А.А., Погосян Г.П., Ли К.Г.

Карагандинский государственный университет им. Е.А. Букетова

Лаборатория ДНК-диагностики «Здравницы Дипнера»

Определение филадельфийской хромосомы у больных хроническим миелолейкозом, проживающих в Карагандинской области

Филадельфийская хромосома (Ph) обнаруживается более, чем у 90% больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) как взрослых, так и детей. Образуется она вследствие реципрокной транслокации между хромосомами 9 и 22 пар - t(9;22)(q34;q11) /1/. В результате транслокации на 22 хромосоме образуется новая патологическая последовательность ДНК, ген BCR-ABL, белковый продукт которого характеризуется повышенной тирозинкиназной активностью, как большинство известных онкопротеинов /2, 3/.

Целью настоящего исследования было определение транслокации t(9;22) методом «реал-тайм-ПЦР» у больных хроническим миелолейкозом, проживающих в Карагандинской области.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. Материалом для наших анализов были периферическая кровь и костный мозг пациентов, обследовавшихся в гематологическом отделении областной клинической больницы г. Караганды. Использовали реактивы фирмы «Амплисенс». Реакцию амплификации ставили в аппарате «ДНК-технологии» в режиме реального времени. Каждый образец использовали в двух повторностях. Кроме того, для каждого варианта использовали по две пробирки внутреннего контрольного образца и положительного контрольного образца.

Методы. Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции для получения кДНК, постановку полимеразной цепной реакции и детекцию продуктов амплификации проводили по инструкциям, приложенным ко всем наборам реактивов в строгом соответствии с требованиями, предъявляемыми к ПЦР-лабораториям.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Метод выявления мРНК гена BCR-ABL в клиническом материале основан на экстракции тотальной РНК из клеток периферической крови и клеток пунктата костного мозга; проведении обратной транскрипции, последующей амплификации с детекцией в режиме «реального времени» с двумя смесями олигонуклеотидов. Первый: амплификация участка мРНК химерного гена М-bcr-abl, соответствующего участку сшивки генов bcr и abl, второй: фрагмента мРНК области сплайсинга гена abl, использованного в настоящем исследовании в качестве эндогенного внутреннего контроля.

Исследованы образцы крови пациентов гематологического отделения Карагандинской областной клинической больницы. Практически все пациенты наблюдались с диагнозом «хронический миелолейкоз» на разных стадиях. Районы проживания объектов исследования: города Караганда, Темиртау, Жезказган, Балхаш, населенные пункты Шетского, Каркаралинского, Казыбекбийского районов, характеризующиеся неблагоприятной экологической обстановкой. Возраст пациентов составлял от 35 до 73 лет. Обследовано 20 образцов крови. В 10 из них обнаружены различные варианты транслокации t(9;22) с образованием патологического гена BCR-ABL. У одного пациента с диагнозом спленомегалия искомая транслокация не выявлена. Филадельфийская хромосома не обнаружена также в крови двух пациентов, обследовавшихся с диагнозом «миелопролиферативное заболевание». В двух случаях выявлена данная транслокация у пациентов с хроническим миелолейкозом на стадии бластного криза. Только в трех образцах крови пациентов с хроническим миелолейкозом не обнаружен исследуемый химерный ген. Полученные результаты согласуются с литературными данными, в соответствии с которыми филадейльфийская хромосома обнаруживается в 90% случаев хронического миелолейкоза, а также в 10% с другими формами лейкозов /4, 5/.

Иллюстрация исследования двух образцов крови на предмет выявления у них искомой транслокации t(9;22)(q34;q11) приведена в Приложении к настоящей статье. В настоящем эксперименте проведена амплификация последовательности bcr-abl у двух пациентов с диагнозом хронический миелолейкоз. В приведенной таблице они обозначены буквами А1 и А3 – первый объект; А2 и А4 – второй.

Из данной таблицы видно, что в образцах с отрицательным контролем (ОКО В5 и В6) не определяется никаких последовательностей, соответствующих искомой, что свидетельствует о достоверности полученных результатов. Кроме того, во всех положительных контролях, использованных в данном исследовании (В1, В2, В3 и В4), а также во внутренних контрольных образцах (ВКО А2, А4, А6 и А8) выявлены амплифицрованные фрагменты гена bcr-abl, что исключает возможность получения ложноотрицательных результатов. Детекция продуктов амплификации в режиме «реального времени» показала положительный результат у второго пациента и отрицательный – у первого. В обоих вариантах первого объекта исследования – А1 и А3 выявляется отрицательный результат. Также в обоих случаях для второго пациента – А2 и А4 обнаруживается амплифицированный фрагмент химерного гена bcr-abl.

Приведенный ниже рисунок доказывается достоверность результатов, зарегистрированных в протоколе данного исследования, где каждый вариант обозначен различными цветами.

В предыдущих исследованиях детекция продуктов амплификации проводилась нами с применением метода электрофореза в агарозном геле, что создавало определенные неудобства, такие как наличие дополнительной комнаты, субъективность оценки результатов исследования и др. Полученные результаты доказывают необходимость применения полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» для выявления филадельфийской хромосомы у больных с различными формами лейкозов.

Дальнейшие исследования предполагают выявление аналогичной транслокации у детей

Список литературы

1. Мельник А.И., Мельник В.А., Цыба Л.Н., Глущенко Э.Н. Клиническая характеристика хронического миелобластного лейкоза у детей раннего возраста//Актуальні питання педагогіки, експериментальної та кліничної медицини/Республіканська збірка наукових праць. - Донецьк, 1995. - С. 243 - 242.

2. Vieira L., Sousa A.C., Matos P., Marques B., Alaiz H., Ribero M.J., Braga P., da Silva M.G., Jordan P. Three-way tranclocation involves MLL, MLLT3, and a novel cell cycle control gene, FLJ10374, in the pathogenesis of acute myeloid leukemia with t(9;11;19)(p22;q23;p13.3) // Genes Chromosome Cancer. 2006 May;45(5):455-469.

3. Junia V. Melo The Diversity of BCR-ABL Fusion Proteins and Their Relationship to Leukemia Phenotype // BLOOD. – 1996. – V.88. – N.7 – P. 2375-2384.

4. Scholl C., Schlenk R.F., Eiwen K., Dohner H., Frohling S., Dohner K., AML Study Group The prognostic value of MLL-AF9 detection in patients with t(9;11)(p22;q23)-positive acute myeloid leukemia // Haematologica. 2005 Dec;90(12):1626-1634.

5. Han J.Y., Theil K.S. The Philadelphia chromosome as a secondary abnormality in inv(3)(q21q26) acute myeloid leukemia at diagnosis: confirmation of p190 BCR-ABL mRNA by real-time quantitative polymerase chain reaction. // Cancer Genet. Cytogenet. 2006 Feb; 165(1): 70-74.

Приложение

Отчет по результатам анализа ПЦР

Дата:

28 Январь 2009, 14:44:51

Оператор:

Гость

Файл с результатами:

C:\Program Files\q_PCR\ПЦР_28_Январь_14_44.rrt

Комментарий:

Программа амплификации:

Ph-chrom (25мкл)

1. 95,0 °C - 15:00

2. 95,0 °C - 00:20

60,0 °C - 00:55

3. 10,0 °C - хранение

Качественный анализ:

2. Флуорофор HEX

№

Идентификатор

Ct (Cp)

Концентрация

22,0

21,8

25,1

26,0

28,6

38,5

29,7

31,9

25,2

26,8

А1,А3 -проба №1, А2,А4-ВКО пробы №1; А5,А7 - проба №2, А6,А8-ВКО пробы №2. В1,В2-ПКО выделения (в т.ч. в ПЦР смеси N), В3,В4 -ПКО ПЦР (в т.ч. в ПЦР смеси N), В5,В6-ОКО (в т.ч. в ПЦР смеси N).

Лаборатория ДНК-диагностики «Здравницы Дипнера»

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Список литературы

Кривая ПЦР