Исаева Г.Ш., Поздеев О.К., Муфер К.

Казанский государственный медицинский университет

Питательная среда для ускоренной идентификации Helicobacter pylori

Ведущим методом лабораторной диагностики H.pylori-инфекции является бактериологическое исследование. Специфичность данного метода составляет 100%, он позволяет не только выделить чистую культуру этого микроорганизма, но и определить чувствительность к химиотерапевтическим препаратам, изучить факторы патогенности, создать банк штаммов, что делает данный метод незаменимым в лабораторной диагностике.

Предложенные среды для выделения H.pylori содержат в основном ростовые факторы, адсорбенты токсических факторов и селективные добавки, тормозящие рост сопутствующей микрофлоры, но не учитывают важный биохимический признак - способность бактерий рода Helicobacter к образованию уреазы.

Целью данного исследования является разработка дифференциально-диагностической селективной среды для ускоренного выделения и идентификации H.pylori – эритрит-сывороточный агар с мочевиной (ЭСАМ).

Материалы и методы. Для исследования были использованы биоптаты слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки от больных с различной гастродуоденальной патологией (15), свежевыделенные штаммы H.pylori (5). Для контроля уреазной активности были использованы тест-штаммы Eschеrichia coli 657 (отрицательный контроль) и Proteus vulgaris 019 (положительный контроль). Для посева на опытную и контрольные среды готовили взвеси трехсуточных культур H.pylori и в соответствии со стандартом по шкале Мак-Фарланд производили 10-кратные разведения до 10 ^-5, а суточные культуры тест - штаммов до 10^-1. Из биоптатов готовили гомогегаты в физиологическом растворе.

Для приготовления опытной среды в термоустойчивую колбу помещали пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, расплавленный эритрит-агар, растворяли в 1000 мл дистиллированной воды и автоклавировали 20 минут при +121^оС. Затем смесь остужали до +50^оС и добавляли бычью сыворотку, мочевину, индикатор и антибиотики (амфотерицин В и ванкомицин). Раствор 1H HCl добавляли по каплям до изменения цвета среды от красного до желтого. Конечный pH среды доводили до 6.00 ед. Среду тщательно перемешивали и разливали в стерильные чашки Петри. После затвердения агара чашки хранили в перевернутом положении при +4^оС. В качестве контрольных использовали три среды: кровяной агар (КА), кровяной агар с амфотерицином В в концентрации 2 мкг/мл (КАА) и эритрит-кровяной агар с амфотерицином В (ЭКАА).

Посевы культивировали в микроаэрофильных условиях в течение 3-7 дней при 37 ⁰С. Принадлежность культур к H. pylori определяли по характерной морфологии колоний, изучения морфологии бактерий при микроскопии мазков из выросших колоний, окрашенных по Граму и разведенным фуксином, изучения «винтообразной подвижности» в препарате «раздавленная капля» методом фазово-контрастной микроскопии, способности к росту в микроаэрофильных условиях, а также определением оксидазной, каталазной и уреазной активности. Параллельно подсчитывали количество выросших колоний H. pylori, пересчитывая на биоптат. Чашки с посевом тест-штаммов инкубировали при +37 ⁰С в аэробных условиях.

Результаты и обсуждение. Результаты представлены в таблице.

Таблица. Сравнительная характеристика эритрит-сывороточного агара и контрольных сред.

Параметр/среда	ЭСАМ (опыт)	КА (контроль)	КАА (контроль)	ЭКАА (контроль)
1. Чувствительность Штаммы H.pylori	10 ^-5	10 ^-5	10 ^-5	10 ^-5
E.coli 657 (контроль)	10^-1	10^-1	10^-1	10^-1
P.vulgaris 019 (контроль)	10^-1	10^-1	10^-1	10^-1
2. Скорость роста H.pylori	3-5 сут	4-5 сут	4-5 сут	4-5 сут
3. Количество колоний H.pylori	38±1,5	28±1,3	32±1,0	36±2,0
4. Частота обнаружения H.pylori в биоптате	80%	67%	80%	80%
5. Средняя обсемененность в биоптате	3,12±0,214	2,11±0,206	3,05±0,225	3,58±0,284

Испытания качества предлагаемой нами среды и контрольных сред показали, что разработанная среда по диагностической эффективности не уступала контрольным средам. Количество положительных образцов составило 80%. Показано, что на предлагаемой среде сохраняются морфологические, культуральные и биохимические свойства выделенных штаммов, что является важным показателем качества питательной среды. Предложенная нами среда обладает рядом преимуществ: ускорение выделения культур H.pylori и возможность непосредственного определения уреазы на среде, минуя проведение дополнительного теста с мочевиной, что значительно (в среднем на 24 часа) ускоряет процесс идентификации возбудителя.

Таким образом, результаты исследований показали, что предлагаемая среда может быть использована в практических лабораториях.