Д.б.н. Перетрухина А.Т., Пуговкин Д.В.

Мурманский государственный технический университет, Россия

Исследование дрожжевых и плесневых грибов в воде Баренцева моря и рыбном сырье

Дрожжевые грибы

Дрожжи — одноклеточные неподвижные организмы, относятся к классу сумчатых грибов - Ascomycetes, подклассу голосумчатых, которые в свою очередь делятся на порядки, семейства и роды. Классификация основана на особенностях их размножения и других морфологических признаках.

Дрожжи широко используются в пищевой промышленности. Способность дрожжей сбраживать сахар, превращая его в спирт и углекислый газ, используется при производстве хлеба, спирта, вин, пива, кваса, молочно-кислых продуктов (кефир, кумыс). Высокое содержание в дрожжах белков и витаминов позволяет использовать их для кормовых и пищевых целей.

Типичными представителями дрожжей являются рода: Candida, Criptococcus, Torylopsis, Rhodotorula. Дрожжи этих родов часто обсеменяют рыбу холодного и горячего копчения, икру и т. д., вызывая их порчу. При производстве консервов встречаются род Saccharomyces, который вызывает спиртовое брожение томат-пасты с образованием пленки на поверхности продукта. Дрожжи родов Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Saccharomycodes, Hanseniaspora широко распространены в природе, встречаются в почве, воде, на фруктах и ягодах. Род Debaryomyces встречаются на мясе, рыбе, колбасах и засоленных овощах. К роду Endomyces относятся мицелиальные дрожжи, вызывающие окисление продуктов. Для них характерно образование шляповидных спор, оидий или конидий.

Плесневые грибы

Плесневые грибы состоят из класса Phicomycetes семейства Mucoroceae (представители — Mucоr, Rhizopus, Fhamnigium) и класса Ascomycetes семейства Aspergillaceae (представители Aspergillus и Penicillium). Среди плесневых грибов наиболее часто встречаются следующие рода Alternaria, Aspergillus, Colletotrichum, Fusarium (F. gibbosum вызывает розовую гниль, при которой на пораженной ткани образуется розовый налет с плотными розовыми подушечками), Oospora, Penicilliuni, Phytophtora. Грибы из этих родов вызывают различные заболевания томатов и порчу пищевых продуктов. Рода Мисоr и Rhizopus поражают томаты одновременно и распространены в почве, навозе, фруктах, воде и на продуктах с высоким содержанием крахмала. Род Phoma вызывает различные типы фомоза, поражая любую часть плодов. Род Diplodina (D. destructiva) вызывает возникновение черной гнили ткань плода становится черной, окруженной светлой зоной. Пораженная ткань покрывается многочисленными черными плодовыми телами гриба и размягчается.

Для развития термофильных плесневых грибов оптимальной является температура 40 - 45°С, но они способны развиваться и при более высокой температуре, 60°С и даже 80°С. Некоторые штаммы пенициллов и аспергиллов хорошо растут при температуре 55°С, а мукоровые - при 65°С. Термотолерантные аспергиллы могут вызывать порчу консервированных продуктов.

Спорообразование плесневых грибов происходит в более узком интервале температуры, чем их вегетативный рост. При этом температурные границы для полового размножения являются более узкими, чем для бесполого размножения.

Существенное значение для роста и развития плесневых грибов имеет влажность. Нижний предел влажности для развития некоторых плесневых грибов может меняться в зависимости от температуры. При этом, чем благоприятнее температура, тем при более низком значении влажности развивается организм. Границы влажности для развития мицелия и органов плодоношения некоторых плесневых грибов могут различаться. Образование органов плодоношения наблюдается, как правило, при более высокой равновесной влажности, чем развитие мицелия.

Плесени могут поражать все виды недостаточно защищенных от нее продуктов. В процессе развития в пищевых продуктах плесневые грибы накапливают спирты, кислоты и другие соединения. Среди органических кислот преобладают пировиноградная, лимонная и янтарная. На рыбных продуктах плесень проявляется в виде пушистых сухих колоний, появляется затхлый запах, возникают другие нежелательные изменения. Развитию плесени способствуют влажность воздуха, плохая вентиляция и колебания температуры. На образование плесени влияют также санитарная обстановка производства, условия транспортировки и хранения продукта.

Афлатоксины

Среди токсических веществ, продуцируемых плесневыми грибами, особое внимание исследователей привлекают афлатоксины. Многочисленными опытами установлено, что афлатоксины являются одними из наиболее сильных гепатотоксинов и гепатоканцерогенов.

Афлатоксины — термоустойчивые органические соединения, не разрушающиеся при автоклавировании, поэтому прошедшие термическую обработку консервы, приготовленные из заплесневелого сырья, могут явиться причиной заболевания.

Продуценты афлатоксинов широко распространены в природе. Наиболее сильными продуцентами афлатоксинов являются грибы рода Aspergillus.

Существующие методы определения афлатоксинов в пищевых продуктах позволили установить, что отсутствие плесневых грибов не всегда свидетельствует об отсутствии в них афлатоксинов, так как плесень может быть удалена при переработке пищевого продукта механическим или иным путем.

В настоящее время выяснена химическая структура афлатоксинов — лактокумариновых соединений с элементарным составом С₁₇Н₁₂О₆ и C₁₇H₁₂O₇. В зависимости от строения молекулы, хроматографических и флюоресцирующих свойств они подразделяются на афлатоксины B₁, B₂, В₃, G₁, G₂, M₁, M₂, В_2а, G_2a, GM₁.

Плесневые грибы вызывают различные микотоксикозы у растений, рыб, животных и человека. Сущность микотоксикозов в том, что токсинобразующие грибы загрязняют или заселяют органы растений, например цветки, плоды или листья, продуцируя при этом или уже во время хранения урожая ядовитые вещества, действующие и после его переработки в корма или продовольствие. В противоположность мицетизму, в случае микотоксикозов грибы съедаются не сознательно, а представляют собой незаметный, неожиданный компонент пищи. Это касается и отравления спорыньей (эрготизма). Хотя склероции Claviceps сами по себе хорошо различимы, после помола зерна в хлебе их уже не разглядеть невооруженным глазом, а к нагреванию ядовитые вещества спорыньи, как и некоторые другие микотоксины, относительно нечувствительны. Чаще всего среди микотоксикозов встречаются афлатоксикозы, вызываемые афлатоксинами или близкими к ним метаболитами (например, стеригматоцистином, верзиколорином) Aspergillus flaws, других видов Aspergillus или иногда Penicillium. Эти грибы встречаются в дробленом арахисе и сходной растительной пище. У человека афлатоксикозы иногда приводят к поражению печени, при длительном воздействии яда могут провоцировать канцерогенез, а для птенцов различных пернатых чреваты летальным исходом. У домашних животных также известны микотоксикозы. Продуценты ядов, - как правило, аскомицеты или дейтеромицеты, чаще всего Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Pithomyces, Stachybotrys и Myrothecium. Микотоксины относятся к разным классам веществ; наряду с упомянутыми соединениями можно назвать цитринин, декумбин, фумагиллин, фумигатин, патулин, роридин, веррукарин и многие другие метаболиты, образуемые более чем 150 видами грибов. Кроме того, к ним, возможно, следует добавить множество токсичных и поэтому обычно не используемых в медицине антибиотиков (Мюллер Э., Лёффлер В., 1995).

Лабораторные исследования

Отбор проб и подготовка их к испытанию осуществляли согласно ГОСТ 26669-85, 26668-85. Из проб воды, сырья или рыбного продукта готовили разведения объемом (1±0,1) см³. Разведения высевают по параллельно в две чашки Петри. Посевы заливают расплавленной и охлажденной до температуры (45±1)°С средой Сабуро, средами с антибиотиками (ГОСТ 10444.12-88). Параллельно с этим заливают чашку Петри 15—20 см³ среды для проверки ее стерильности. Посевы термостатировали при температуре (24±1)°С в течение 5 суток.

Через 3 суток термостатирования проводили предварительный учет типичных колоний или появления характерных признаков роста на жидких питательных средах.

Если в посевах на агаризованных средах присутствовали мукоровые, очень быстро растущие грибы, то снятие предварительных результатов необходимо проводить очень осторожно, не допуская того, чтобы споры этих грибов осыпались и дали рост вторичных колоний. Через 5 суток проводят окончательный учет результатов термостатирования посевов. Колонии дрожжей и плесневых грибов разделяют визуально. Рост дрожжей на агаризованных средах сопровождается образованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем. Развитие дрожжей в жидкой среде сопровождается появлением мути, запаха брожения и газа. Развитие плесневых грибов на питательных средах сопровождается появлением мицелия различной окраски.

Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

При необходимости для разделения колоний дрожжей и плесневых грибов проводят микроскопические исследования. Для этого из отдельных колоний или из посевов на жидкую среду готовят препараты методом раздавленной капли. На предметное стекло наносят каплю стерильной водопроводной воды. Затем в эту каплю прокаленной иглой вносится часть колонии или петлей наносят каплю культуральной жидкости. Полученная суспензия покрывали покровным стеклом. Дрожжи - одноклеточные микроорганизмы, клетки круглой, овальной или продолговатой формы, длиной от 2,5 до 30 мкм и шириной от 2,5 до 10 мкм, часто почкующиеся Плесневые грибы - состоят из нитей-гифов, без перегородок или септированных на клетки. Гифы образуют боковые выросты и разветвления, от вегетативных гифов поднимаются гифы, несущие плодовые тела. Результаты оценивали по каждой пробе отдельно. Если при испытании продукта на питательных средах обнаружили рост дрожжей и плесневых грибов и их присутствие подтвердили микрокопированием. Результаты обрабатывают и пересчитывают отдельно для дрожжей и плесневых грибов.

Количество дрожжей и плесневых грибов в 1 г или в 1 см³ продукта (X) вычисляют по формуле

где Σ С - сумма всех подсчитанных колоний на чашках Петри в двух последовательных десятикратных разведениях при условии.

n₁ — количество чашек Петри, подсчитанное для меньшего разведения, т. е. для более концентрированного разведения продукта;

n₂ — количество чашек Петри, подсчитанное для большего разведения;

n — степень разведения продукта (для меньшего разведения).

Результаты и обсуждение

В морской воде юго-западной части Баренцева моря составило 2-3 % в среднем за год. В осенне-зимний период их количество составило 8 %, а весенне-летний период 3 %. В сточной воде Мурманского рыбокомбината грибов составило до 20 %.

В различных видах выловленной рыбы Баренцева моря количество дрожжевых и плесневых грибов от 5 до 12 %. Таксономический состав микроорганизмов на поверхности здоровой и снулой рыбы в разное время года от общего числа выделенных бактерий составило: у здоровой рыбы в весенне-летний период от 2 до 5 %, а у снулой в этот период от 5 до 8 %; в осенне-зимний период у здоровой рыбы этот показатель остался прежним, а у снулой составил 5-15%. У здоровой рыбы преобладали плесневые грибы рода Mucоr и дрожжи рода Rhodotorula. У снулой рыбы преобладали плесневые грибы - Aspergillus, Fusarium, что, возможно, явилось причиной заболевания и снулости.

Список использованной литературы:

1. Обнаружение и количественный учёт грамположительных микроорганизмов в водных объектах и гидробионтах в условиях Кольского Заполярья: методическое пособие. Утверждено главным врачом Центра госсанэпиднадзора по Мурманской области / Научный консультант Перетрухина А.Т. - Мурманск, 2001. - 67 с.

2. ГОСТ 10444.12-88 Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов.

3. Мюллер Э., Лёффлер В. Микология: пер с нем. - М.: Мир, 1995. - 343 с.

4. Перетрухина А.Т., Перетрухина И.В. Микробиология сырья и продуктов происхождения: - СПб, ГИОРД, 2005. - 320 с.

5. Перетрухина А.Т. Практикум по общей микробиологии: учеб. пособие. - Мурманск, 1997. - 170 с.